التحليل الكروماتوغرافي

التحليل الكروماتوغرافي :

- يعتمد هذا النوع من التحليل على اختلاف المواد بعضها عن بعض في ميلها للأمتزاز أو التجزئة أو التبادل خلال سطح مغلف بمذيب مناسب أو خلال مادة كيميائية ومن ثم يمكن أن تنفصل تلك المواد ،

وتنقسم طرق التحليل الكروماتوغرافي إلى

: أ‌- كروماتوغرافيا الأدمصاص :

- ويقصد به التحليل الكروماتوغرافي عن طريق الأدمصاص على السطح.

ب- كروماتوغرافيا التبادل الأيوني :-

- ويقصد به التحليل الكروماتوغرافي عن طريق تبادل الأيونات بين مادة التقدير وبين أيونات السطح الذي يحدث عملية التبادل وهي مادة كيميائية راتنجية .

ج- كروماتوغرافيا التجزئة :-

- ويقصد به التحليل الكروماتوغرافي عن طريق الفصل التجزيئي لمخلوط من عدة مواد وتنقسم هذه الطريقة

إلى كروماتوجرافيا العمود بالتجزئة ويتم فيها التحليل على عمود معبأ بمادة معينة .

د- كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة :-

- وفيه يتم التحليل الكروماتوغرافي بالأدمصاص أو التوزيع على ألواح زجاجية تنثر عليها مادة مسامية يجرى عليها الفصل والتحليل .

هـ- كروماتوغرافيا الغاز :

- يتضمن هذا التحليل الكروماتوغرافي باستخدام غاز ناقل يقوم بحمل أبخرة المواد المحللة فيتم اتصال أبخرة هذه المواد تبعًا لدرجات غليانها أي تظهر أولا ً المواد ذات درجات الغليان المنخفضة يتبعها المواد ذات درجات الغليان العالية وتخرج هذه الأبخرة لتنضم إلى الغاز الناقل ومن ثم يمكن فصل هذه المواد

عن بعضها وتعينها ويمكن أيضًا بطريقة كروماتوغرافيا الغاز إجراء التقدير الكمي لهذه المواد المنفصلة

اولاً : كروموتوغرافيا الامتزاز : Adsorption ... :

وتعرف كذلك بكروموتوغرافيا سائل-صلب LSC وهي من أقدم طرق الفصل وتتضمن احتجاز المكونات المراد فصلهاعلى مواقع فعالة مثل (-OH) على سطح المادة المازة التي تشمل السيليكا وأكسيد الألمنيوم (الألومينا) .

وتتنافس جزبئات السائل اللافظ , وهو عادة غير قطبي ممزوج مع كميات ضئيلة من الماء أو الميتانول مع مكونات الخليط على هذه المواقع الفعالة مما يؤدي إلى حدوث عملية الفصل .

وبنطبق هذا المبدأ على عدد من أنواع الكروموتوغرافيا التي تشمل الكروموتوغرافيا الورقية وكروموتوغرافيا الطبقة الرقيقة TLC وكروموتوغرافيا سائل-سائل LLC .

-----------------------------

ففي كروموتوغرافيا التجزئة , وهي من أهم أسس الفصل الكروموتوغرافي ذات الاستعمال الواسع في تحليل الأغذية , يجمع الطوران غير الممتزجين ليمر أحدهما فوق الآخر حيث يكون أحدهما الطور الثابت والآخر الطور المتحرك . ويتوزع الطور الصلب ويُحتجز على دعامة مناسبة , بينما يمرر فوقه المتحرك عبر العمود بمعدل تدفق معين . وباختيار الأطوار المناسبة , تنقص مكونات العينة بين الطورين وتنفصل تدريجياً إلى عصابات في الطور المتحرك . ويعتمد فصل المكونات على الانحلال النسبي للمكونات المراد تفريقها في الطورين ,

فإما أن يكون الطوران سائلين (وهذا يعطي الاصطلاح الوصفي :كروموتوغرافيا سائل-سائل ) وإما أن يكون أحد الطورين سائلاً أو غازياً , ومنه جاء اصطلاح كروموتوغرافيا سائلة-غازية GLC . ولكنها عادة إلى كروموتوغرافيا غازية GC حيث يغلف الطور السائل حبيبات داعمة صلبة خاملة بينما يمر الطور المتحرك خلالها بمعل تدفق محدد .

الترشيح الهلامي : Gel filtratoin : وتعرف أيضاً بكروموتوغرافيا النخل أو الاستبعاد حيث تفصل الجزيئات على أساس حجمها أو شكلها , حيث تنفذ الجزيئات الصغيرة إلى مسامات الخلام وتمسك هناك , بينما تجرف الجزيئات الكبيرة التي لا يمكن أن تنفذ من المسام إلى خارج العمود . وهناك شكل اختياري من الكروموتوغرافيا يشمل كروموتوغرافيا الألفة Affinity التي تقوم على أساس الألفة العضوية بين نوعين من الجزيئات

مثل الأنزيم ومثبطه Inhibitor , حيث يرتبط أحدهما بالطور الثابت ويستعمل الآخر في سائل الالتفاظ

مما يسمح بفصل أحد المكونات البيولوجية في مزيج من المكونات الأخرى

[ثانياً : كروموتوغرافيا التبادل الأيوني : :Ion-exchange Chromatography :

===============================================

وهي طريقة كرماتوغرافيا سائلة وإنما تختلف عن الطرق الأخرى بأن الطور الثابت مؤلف من مادة خاملة مثل السيليكا أو البولي سيتارين المحتوي على مكونات أيونية مثل مجموعات الكربوكسيل أو السيلفوهيدريل ,

أو مجموعات الأمونيوم في المبادل الأيوني , حيث يمكن أن تتادل المكونات الأولية في العينة المارة في العمود

مع المكونات الأيونية في الطور الثابت مؤدية إلى فصلها عن مكونات العينة الأخرى .

ثالثاً :الكروماتوغرافيا الغازية : Gas Chromatography

================================

تعد هذه التقنية وسيلة تحليلة مهمة لمحلل المواد الغذائية . وتكتسب أهميتها في دراسة تركيب الحموض الدهنية في الدهون والزيوت . يتكون الطور الغازي (المتحرك) من غاز الهيدروجين أو الهيليوم ينساب عبر عمود في درجة حرارة معينة تتراوح بين 60م إلى أكثر من 200م ,

ويستعمل نوعين من الأعمدة في تحليل الأغذية هي الأعمدة المحشوة والأعمدة الشعرية .

ويكون الطور الثابت في الأعمدة المحشوة مثبتاً على وسادة أو مسند صلب خامل داخل العمود المعدني أو الزجاجي .

تمتاز هذه الأعمدة المحشوة بإمكان حشوها وإعادة إفراغها عندما تتراجع كفاءتها .

أما الأعمدة الشعرية , التي تمتاز بقدرتها الفائقة على الفصل وتفوقها على الأعمدة المحشوة ,

فيكون الطور الثابت فيها عبارة عن طبقة رقيقة من السيليكون ترتبط بجدران العمود الشعري الداخلية . وهي أكثر طولاً من الأعمدة المحشوة وأغلى ثمناً وترمى عند الانتهاء منها . وتستعمل في أجهزة الكروموتوغرافيا الغازية مكشافات تأين اللهب Flame Ionisation Detector FID

الواسعة الاستعمال لشدة حساسيتها وملائمتها لكشف معظم المركبات العضوية . في هذه المكشافات يضاف غاز الهيدروجين إلى وسط الانبثاق في العمود ويمر المزيج إلى منفث Jet حيث يخلط مع الهواء ويحرق , مما يؤدي إلى تكون الأيونات الحرة والإلكترونات الحرة مما يتولد عنه تيار كهربائي يسري بين الكترودين .

فعندما تدخل اللهب مادة من وسط انبثاق العمود قابلة للتأين يزداد التيار بشكل واضح ويكون كِبَره قياساً لكمية المكون في وسط الانبثاق وكتا قد تحدثنا عن الكروموتغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة

تطبيقات التحليل الكروموتغرافي

أولاً :تعيين الكحول في المشروبات الكحولية بالكروموتوغرافيا الغازية :

[Determination of beverages by gas chromatography ]

المبدأ :

يقدر الكحول (الإيتانول) في المشروبات باستعمال تقنية الكروماتوغرافيا الغازية حيث يستعمل البروبانولكمعيار داخلي . يضاف كمية معينة من البروبانول إلى المشروب , وبعد الفصل بالكروماتوغرافيا الغازية , تؤخذ نسبة مساحة قمة الإيثانول إلى البروبانول لحساب مقدار الإيثانول . ويمكن استعمال محاليل الإيتانول بتراكيز معلومة لإنشاء المنحني المعياري .

الأجهزة :

دوارق حجمية . ماصات . جهاز كروماتوغرافي غازي بعمود Porapak Q (أو ما يشابهه) . مجفف درجة حرارته 166م .

طريقة العمل :

حضر في سلسلة من الدوارق الحجمية سعة 100 مل محاليلاً من الإبثانول بتراكيز :

1 2 3 4 6 8 10 بالمائة حجماً , أضف إلى كل دورق 2 مل من البروبانول لإعطاء حجم كلي 102 مل .

املأ الدورق المعياري 100 مل إلى العلامة بالمشروب المراد تحليله وأضف 2 مل بروبانول . امزج جميع الدوارق جيداً عدة مرات .احقن عدة عينات من كل دورق من الدوارق السابقة في جهاز الكروماتوغرافيا الغازية , وقس مساحات القمم الناتجة (مستعملاً المكامل الحاسوبي إذا كان متوافراً) . ارسم العلاقة بين نسبة مساحة قمتي (الإيثانول : البروبانول) مع كمية الإيتانول , واستعمل المنحني ونسبة (الإيتانول : البروبانول)

لعينة المشروب لتعيين مستوى الكحول في عينة منه .

المصدر/"كيمياء تحليل الأغذية ... "تأليف : C.S.James ترجمة : أ.د. أكرم العودة أ.د. غياث سمينة

==================================================

ثانياً : استخدام كروماتوغرافيا الأعمدة في [ فصل السيس و الترانس –ازوبنزين

من المعلوم ان اي عينة عادية من الازوبنزين azobenzene تحتوي على 1% منه

بصورة السيس و هو اقل ثباتا من صورة الترانس ، و عند تعرض المركب للاشعة فوق البنفسجية تزداد نسبة صورة السيس و هنا طريقة الفصل باستخدام الاعمدة توضح مدى قدرة على فصل السيس و الترانس للازوبنزين .

تحضير المحاليل :

1-حضر محلولا من الازوبنزين و ذلك باذابة 0.5غم من الازوبنزين

في 5مل من الايثر البترولي.

2-حضر عمود الفصل مستخدما الايثر البترولي كمذيب

و اكسيد الالومينا الحمضية (حوالي 25غم) كمادة مدمصة (adsorbant) لتعبئة العمود .

خطوات العمل :

1-عرض عينة الازوبنزين المذابة في ايثر البترول للاشعة فوق البنفسجية لمدة نصف ساعة حيث يتحول بهذه العملية جزء من صورة الترانس ازوبنزين الى صورة اليس ازوبنزين نتيجة امتصاص الطاقة .

2-انقل بسرعة محلول الازوبنزين الى عمود الفصل و اسمح للمذيب بالتحرك خلال العمود بسرعة انسياب 1-2ملدقيقة .

3-اضف 25مل ايثر البرول الى عمود الفصل لتخليص (elute) الترانس ازوبنزين ذو اللون الاحمر البرتقالي ، في حين يبقى السيس ازوبنزين ذو اللون الاصفر كحلقة في الجزء الاعلى من العمود و اجمع المحلول المخلص في كاس .

4-غير الكاس عندما تلاحظ ان الحلقة الخاصة بالترانس ازوبنزين اخذة في الاقتراب من اسفل العمود و ان ناتج الاستخلاص اصبح عديم اللون .

5-غير المذيب الى ايثر البترول المحتوي على 3% من الميثانول و ذلك لتخليص السيس ازوبنزين.

6-اجمع الجزء المحتوي على السيس ازوبنزين و اغسله بالماء للتخلص من الميثانول و جفف باستعمال Na2SO4 و بخر المذيب تحت الضغط المنخفض باستخدام مجفف زجاجي موصول بمضخة تفريغ للحصول على بلورات من السيس ازوبنزين ذات درجة الانصهار 61م.

7-بخر المذيب الذي يحتوي على الترانس ازوبنزين للحصول على بلوراته ذات درجة الانصهار 68م.

[ملاحظـــــة:

الخطوة رقم 6 ينبغي ان تتم بسرعة كبيرة في مكان معتم و بدون وجود ضوء مباشر حتى لا تتحول السيس ازوبنزين الى الترانس ازوبنزين

==================================

رابعاً : طرق الكروماتوغرافي عالي الكفاءة ( عالي السرعه ) للسوائل ( High Performance Liquid_Chromatogr*

تعتبر هذه الطريقه أهم تطوير في طرق الفصل الكروماتوغرافي للسوائل وفيها يكون الوسط الساكن على هيئة جسيمات دقيقه الحجم ويدفع بالوسط المتحرك ( السائل ) خلال العمود المملوء بالوسط الساكن بإستخدام مضخه عند ضغوط تصل إلى 8000 رطل على البوصه المربعه (Psi ) وتستخدم المضخه لتيسير سريان الوسط المتحرك خلال العمود بسرعات تتراوح بين 50،0ــ 5 مل/ دقيقه بالرغم من أن جسيمات الوسط الساكن يصل قطرها إلى عدة ميكرو مترات فقط .

وقد أمكن بالفعل الحصول على سرعات سريان تتراوح بين 1ــ4 مل/ دقيقه بإستخدام أعمدة مملؤه بجسيمات يصل نصف قطرها إلى 5 ميكرو متر . وبهذه الطريقه يمكن فصل المركبات صعبة التطاير أو تلك التي تتأثر بالحراره .ويمكن في هذه الطريقه إستخدام جسيمات دقيقه من مادة صلبه لها خاصية الإدمصاص كوسط ساكن أومواد لها خاصية الإستبدال الأيوني وكذلك المواد الهلاميه ذات المسامات المحدده . ويمكن أيضاً إستخدام سائل محمل على جسيمات دقيقه من مادة صلبه .وهناك ثلاثة طرق عامه لتحضير الأوساط الساكنه التي تناسب العمل بهذه الطريقه وقد كان لإكتشاف هذه الطرق الفضل في سرعة إنتشار إستخدام هذه الطريقه

*وهذه الطرق هي :

1- ربط السائل المستخدم كوسط ساكن برابطه كيميائيه مع جسيمات الماده الصلبه الخامله مثل رابطة C-Si التي تقاوم التميه( hydrolysis ) . وتستخدم هذه الطريقه لتحميل الهيدرو كربونات المشبعه طويلة السلسله والاثيرات المفلوره على هلام السيليكا .

2- تحميل الوسط الساكن كطبقه رقيقه جداً (stationary phase ( Pellicular على سطح جسيمات الماده الصلبه وذلك لتقليل ممرات الإنتشار والإنتقال خلال الوسط الساكن ، وهذا بالطبع يزيد من سرعة عملية الفصل . وقد أمكن بإستخدام هذه الطريقه تحميل أوساط ساكنه على شكل طبقه رقيقه من مادة هلام السيليكا أو مبادل أيوني أو سوائل مرتبطه كيميائياً مع الطبقه المساميه الخارجيه . ولكن من عيوب هذه الطريقه قلة سعة الوسط الساكن ( Capacity ) مما يستلزم إستخدام تركيزات منخفضه جداً من العينه لضمان عدم تحميل عمود الفصل فوق طاقته ( Overloading ) .

3- إستخدام الوسط الساكن على شكل جسيمات مساميه كرويه منتظمه ذات أنصاف أقطار صغيره جداً مثل 20،15،10،5 ميكرومتر ، وفي هذه الحاله يمكن إستخدام أعمدة قصيره ( 10ـ25 سم ) حيث ثبت أن كفاءتها أعلى وسعتها أكبر من الأوساط الساكنه القشريه .والمضخه المستخدمه لدفع الوسط المتحرك مصممه بحيث تعطي ضغطاً ثابتاً أوسرعة سريان ثابته ويستخدم في نهاية العمود كشافات عالية الحساسيه . ويتراوح طول أعمدة الفصل عادة من 25 سم إلى 2 متر ، ونصف قطرها بين 1ـ5 مم ، وهي تصنع إما من الزجاج أو من الحديد الصلب المقاوم(عديم الصدأ ) ( Stainless steel ) . ويكشف عادة عن المكونات المفصوله من العمود بصوره مستمره وذلك بملاحظة الإمتصاص الطيفي لمحاليل المذابات المفصوله أو بمتابعة معامل إنكسارها .

كما يمكن إستخدام كشاف يعتمد على خاصية تأين المذابات

في اللهب ( Flame ionization detector ) وذلك بعد تبخير المذيب منها . وبالرغم من حداثة هذه الطريقه من طرق الفصل إلا أن إستخدامها ينتشر بسرعه كبيره نظراً لكفاءتها المتميزه وسرعتها العاليه . فمثلاً يمكنفصل خمس مركبات عطرية هيدروكسيليه في أقل من 60 ثانيه . وتعتبر درجة الحراره من المتغيرات التي يمكن التحكم فيها في هذه الطريقهللحصول على كفاءه أعلى للفصل . وقد نجحت هذه الطريقه في فصل العديد من المخاليط التي لم يكن فصلها سهلاً بالطرق العادية .

============================================

خامسا : الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة Paper and thin-layer chromatography

يمكن أن توصف أنواع هذه الكروموتوغرافيا بأنها أنواع من كروموتوغرافيا امتزاز سائل على صلب ,

وتستعمل في كشف المكونات الضئيلة وتعيينها في المواد الغذائبة مثل الملونات . ولكنها محدودة الاستعمال في القياسات الكمية للمكونات الكبيرة للأغذية . يسمح استعمال السيللوز في الكروموتوغرافيا الورقية باستعمال الماء كطور ثابت حيث يمتز بين ألياف السيللوز . وتستخدم الطبقة الرقيقة مبدأً مشابهاً لاستعمال الورقة ولكن باستخدام

أنواع مختلفة من المواد , تسمح بالفصل بالامتزاز أو التبادل الأيوني أو الارتشاح عبر الهلام . وتتمبز هذه التقنية بفصلها المتفوق للمكونات وسرعة إجرائها مما هو عليه في الكروموتوغرافيا الورقية . وتوصف المكونات الفردية في طريقتي الكروموتوغرافيا الورقية والطبقة الرقيقة بخاصة قيمة التأخر R retardation value :

التي تعطى بالعلاقة : R=المسافة التي يقطعها المكون المسافة التي يقطعها المذيب . ]تستخدم في عمليات الفصل السريع و في تحليل الكميات القليلة من المواد و يعود ذلك للاسباب التالية :

1- بساطة الطريقة و عدم الحاجة الى اجهزة معقدة .

2- إمكانية الوصول الى جودة الفصل نفسها التي تعطيها الطرق الكروماتوغرافية الاخرى .

3- إمكانية الوصول الى فصل انتقائي باستخدام كواشف خاصة .

و تتم عملية الفصل على طبقة رقيقة من مادة الوسط الثابت المفروشة على الواح مصنوعة من الزجاج او البلاستيك او الالمنيوم .و يعتمد الفصل في هذه الطرق اما على ظاهرة الادمصاص او ظاهرة الاستبدال الايوني .

و هذه الظاهر تعتمد على تركيب كل طبقة من الوسط الثابت و الوسط المتحرك .

الا ان تطبيقاتها المعتمدة على ظاهرة الادمصاص هي الشائعة حيث ينظر الى كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على انها كروماتوغرافيا ادمصاص .

خطوات العمل بكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة :

1- تجهيز الواح الطبقة الرقيقة .2اختيار الوسط المتحرك المناسب.3- وضع عينة على لوح الطبقة الرقيقة .

4- تظهير البقع المفصولة و التعرف على مكوناتها.5- حساب معامل الاعاقة Rf(Refracive index)

(1) تجهيز الواح الطبقة الرقيقة ( الوسط الثابت) :

ان المواد المدمصة في TLC هي نفسها المدمصة في كروماتوغرافيا الاعمدة .هذه الالواح تكون مصنوعة و مجهزة للاستخدام مباشرة .(2) اختيار المذيب المناسب (الوسط المتحرك)

يعتمد اختيار المذيب على نوع المادة المراد فصلها و قد يكون ضروريا اختيار عدد من المذيبات لاجراء عمليةالفصل و يكون الاختيار التقريبي سهلا .فالمذيب الذي له قطبية عالية يؤدي الى تحريك البقع مع جبهة المذيب، في حين ان المذيب غير القطبي لا يؤديالى تحريك البقع مع المذيب ، و يعتبر الكلوروفورم و البنزين من المذيبات المتوسطة القطبية التي تستخدم بصورة واسعة لفصل العديد من المركبات .

(3) وضع العينة

يتم وضع حجم معين في حدود 5-20 ميكرولتر من العينة التي تركيزها 0.1-5% بواسطة ماصة دقيقة او محقن دقيق على خط نقطة البداة الذي بيعد 2 سم من احد اضلاع اللوح .و ينبغي الا يزيد قطر البقعة عن 1سم . و للمحافظة على بقاء البقعة صغيرة توضع العينة باحجام صغيرة عدة مرات مع التجفيف بعد كل اضافة.

(4) طرق تظهير البقع المفصولة (Visualization Method)

طرق الفصل سهلة في حالة المواد المفصولة ملونة ، الا انه في اغلب الحالات تكون المواد المفصولة عديمة اللون و يجب جعلها في هذه الحالة ملونة باستعمال بعض الكواشف ،

و تسمى هذه بكواشف التظهير .يعتبر اليود من اكثر كواشف التظهير استخداما حيث يتفاعل مع اغلب المواد العضوية معطيا متراكبات لها الوان اما بنية او صفراء . و هناك طرق اخرى مثل تظهير هاليدات الالكيل برش لوح الطبقة الرقيقة بمحلول مخفف من نترات الفضة حيث تتكون هاليدات الفضة

التي تتفكك بتأثير الضوء معطية بقع سوداء من رقائق الفضة على الطبقة الرقيقة .ايضا هناك استخدام مصباح الاشعة فوق البنفسجية و هي غالبا ما تظهر المركبات المفصولة على شكل بقع براقة ساطعة على الطبقة الرقيقة و بعضها يظهر عليه فقط خاصية التالق(Flourescence) .و هناك ايضا اضافة مادة متالقة الى الوسط الثابت في الطبقة الرقيقة مثل خليط من كبريتات الزنك و الكادميوم . و اذا كانت المركبات المفصولة تسبب اخماد التالق(quenching flourescence) فانها ستظهر على هيئة بقع سوداء على الصفيحة عند تعرضها للاشعة فوق البنفسجية .

(5) معامل الاعاقة

عند تثبيت كل الظروف على الطبقة الرقيقة و التي تشمل :

1-المذيب المستخدم. 2- المادة المدمصة المستخدمة كوسط ثابت . 3- سمك الطبقة الرقيقة 4- كمية العينة.

فإن اي مركب سيقطع مسافة ثابتة بالنسبة الى المسافة التي تقطعها جبهة المذيب .

و تعرف النسبة بين المسافة التي تقطعها المادة المفصولة و المسافة التي تقطعها الجبهة المذيب بمعامل الاعاقة و يرمز لها بالرمز Rf .و معامل الاعاقة = المسافة التي تقطعها المادة المسافة التي تقطعها جبهة المذيب

و يكون معامل الاعاقة ثابتا للمركب المعطى عندما تكون كل ظروف التجربة هي نفسها و هو يمثل احد الصفات الفيزيائية لهذا المركب .و يمكن التعرف الى المادة المجهولة عن طريق حساب تلك المسافات من نقطة البداية الى مركز القطعة .

[تقنية الفصل:]تجربة

نستخدم الأدوان الموضحة بالشكل

يتم الفصل بهذه الطريقة بوضع قطرة من المحلول الذي يحتوي على الخليط المراد فصل مكوناته على بعد 2سم من احد اضلاع اللوح .

[كما في الشكل التالي

ثم يوضع اللوح في وعاء مغطى يحتوي على كمية من المذيب المستخدم بحيث لا يزيد ارتفاع المذيب في الوعاء عن 1سم .

كما في الشكل التالي

و بعد وقت قصير يبدأ المذيب في التحرك الى اعلى مارا بالبقعة التي تحتوي على الخليط و يبدا فصل مكوناته حسب قوة ادمصاص كل منها على سطح الوسط الثابت ، و ينتج عن ذلك فصل بقعة الخليط الى عدة بقع . و عندما تقترب جبهة المذيب من نهاية اللوح نخرج اللوح من الوعاء و نقوم بتحديد المكان الذي وصلت اليه جبهة المذيب لمعرفة المسافة التي قطعها المذيب . ثم نحدد مواقع البقع المفصولة .

كما في الشكل التالي:

ونصل إلى النتيجة النهائية كما في الشكل التالي

و تقاس المسافة التي قطعتها البقع مباشرة اذا كانت هذه المواد المفصولة ملونة اما اذا كانت غير ملونة فلابد من اتباع احد الطرق المذكورة سابقا لتظهير البقع .

]مثال لعملية فصل [

فصل مكونات نبات السبانخ الاخضر بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

تعتمد طريقة فصل مكونات النبات الاخضر على اختلاف ادمصاص المادة الخضراء على سطح هلام السيليكا الموجودة على شكل طبقة رقيقة . و تشبه هذه الطريقة الى حد كبير طريقة الفصل الكروماتوغرافي بواسطة العمود .

]المواد المطلوبة و تحضير المحاليل [

1-هلام السيليكا 2-كلوروفورم3-اسيتون4-بنزين5- كحول ايزوبروبيلي6- ايثر البترول الخفيف الذي درجةغليانه تتراوح بين 30-50م7- رمل معالج بحمض الهيدروكلوريك

8- حضر 25مل من كل من الكلوروفورم و الكاروتين و الكزاينوفيل في الكلوروفورم بتركيز 10% وزن لوزن w/w .

[خطوات العمل

(1)حضر الواح الطبقة الرقيقة و ذلك بمزج كمية مناسبة من هلام السيليكا مع 3 مل من مزيج مكون من 1 مل كحول ميثيلي و 2 من الكلوروفورم ثم افرش العجينة على سطح لوح زجاجي باستخدام قضي زجاجي .

(2)استخلص المادة الخضراء من السبانخ و ذلك بأخ 1 جرام من السبانخ و طحنها في هاون صغير مستخدما 5مل من الاسيتون أو الكلوروفورم مع اضافة كمية مناسبة من الرمل و ذلك لتسهيل عملية الطحن .

و افصل المذيب الذي يحوي المادة الخضراء بعد الطحن الجيد.

(3)ضع على لوح الطبقة الرقيقة و على مسافة 2 سم من حافتها مستخلص السبانخ على شكل قطرات متتالية.

(4)ضع على لوح الطبقة الرقيقة نفس وعلى بعد 2 سم من حافة محاليل كل من الكلوروفيل و الكاروتين و الكازاينوفيل على شكل قطرات متتالية بحيث تكون المسافة ما بين البقع الناتجة عن المكونات بحدود 2 سم .

(5) ضع لوح الطبقة الرقيقة في الخزان الكروماتوجرافي الذي يحوي المذيب

المكون من البنزين و إيثرر الرول و الكحول الأيزوبروبيلي بنسب حجمية 5 : 5 : 1 على التوالي .

وينبغي ألا يصل مستوى سطح المذيب في الخزان الى بقعة العينة المراد فصل مكوناتها .

(6)اترك لوح الطبقة الرقيقة في الخزان حتى تصل جبهة المذيب الى ما قبل نهاية الطرف العلوي .

(7)أخرج لوح الطبقة الرقيقة ولاحظ انفصال مكونات العينة إالى عدة بقع ملونة ، رتب هذه البقع حسب قوة ادمصاصها و احسب معامل الاعاقة لكل منها . وتعرف على مل مكون تم فصله من السبانخ بمقارنة لونه

و معامل إعاقتع بلون و معامل الاعاقة لكل من الكلورفيل و الكاروتين و الكزاينوفيل

ملاحظة

=====

يمكن أن يحمل على خط التحميل أكثر من بقعة حسب عرض الورقة, بعد جفاف الورقة توضع ضمن المقياس المدرج بحيث لا تمس جدرانه و بحيث يكون خط التحميل فوق سطح المحل الحامل بحوالي 1cm يغلق الوعاء و تترك الورقة فترة من الزمن حتى يصل المحل الحامل الى ما قبل نهاية الورقة بحوالي 2cm .......)

معلومات اكثر من رائعه
جزاك الله كل خير على افااده الناس بما اوتيت من علم
بارك الله في عملك وجهدك وجعلة الله تعالى في ميزان حسناتك
وسعداء جدا بتواجدك معنا
تحياتي

مشكووووووووووووووووووووووووووووور

نشكركم على هذا المجهود الرائع متمنيين لكم دوام العطاء